Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒说明书
Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit
货号:K2579
保存:2-8 ℃避光保存
组分说明
Cat.No. K2579
KitSize 50
4×BindingBuffer 10ml
7-AADViabilityStainingSolution 500 μl
AnnexinV-PE 250 μl
产品简介
AnnexinV-PE/7-AAD 流式检测试剂盒是一种采用 Annexin-PE 与 7-AAD 双染法进行细胞早期凋亡分析的检测试剂盒。
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。AnnexinV 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性,对 PS 有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所*的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就被破坏。7-AAD (7-amino-actinomycinD)是一种核酸染料,可进入死细胞内与 DNA 结合,能够对坏死和凋亡晚期的细胞进行染色。7-ADD 与PI有着相似的荧光特性,但其发射波谱较PI 窄,对其他检测通道的干扰更小,在多色荧光分析中是PI 的最佳替代品,因此通常将Annexin V-PE 与 ADD 配合染色,以区别凋亡早期细胞与坏死细胞和凋亡的晚期细胞。
注意事项
1. 消化细胞时不能用含EDTA 的胰酶。
2. 本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。
3. 需自备PBS 和去离子水。
4. 荧光染料均存在淬灭问题,保存和使用过程中请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
5. PI 对人体有刺激性,请注意适当防护。
6. 请穿实验服并戴一次性手套操作。
操作步骤
1. 细胞样品的准备:
a. 对于贴壁细胞:小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞,至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时,加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000×g 左右离心3-5 分钟,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞沉淀不充分,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约50μl 左右的培养液,以避免吸走细胞。加入约1 ml 4℃预冷的 PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。再次加入1ml4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞。
b. 对于悬浮细胞:1000×g 左右离心3-5 分钟,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞沉淀不充分,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约 50 微升左右的培养液,以避免吸走细胞。加入约1 ml 4℃预冷的PBS,重悬细胞,并转移到1.5 毫升离心管内。再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,可以残留约 50μl 左右的 PBS,以避免吸走细胞。再次加入1ml4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞。
2. 用去离子水按1:4 稀释 BindingBuffer(4mlBindingBuffer+12ml 去离子水);
3. 用 250μlBindingBuffer 重新悬浮细胞,调节其浓度为1×106/ml;
4. 取 100 μl 的细胞悬液于 5ml 流式管中,加入 5 μlAnnexinV-PE 和 10 μl7-AAD 溶液;
5. 混匀后于室温避光孵育 15 分钟;
6. 在反应管中加 400μlPBS,流式细胞仪(FACS)分析。
实验代做服务:
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