牛呼吸道疾病综合症（BRDC）核酸检测试剂盒（荧光RT-PCR法)

【产品名称】

商品名称：牛呼吸道疾病综合症（BRDC）核酸检测试剂盒（荧光RT-PCR法）

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

牛呼吸道综合症是由病毒和细菌等多个病因相互作用的多重感染引起的。具体因素有天气和饲料的改变、畜舍过于拥挤、动物缺乏休息、牛棚不舒适、长途运输后等。在这种情况下，瘦弱而营养不良的幼畜十分容易患上牛呼吸道综合征。本试剂盒适用于检测牛呼吸道分泌物，鼻眼分泌物，肺部等样本中的牛呼吸道疾病综合症RNA，适用于牛呼吸道疾病综合症感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒用1对牛呼吸道疾病综合症特异性引物，结合1条特异性荧光探针，用一步法荧光RT-PCR技术对牛呼吸道疾病综合症RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融不超过5次，有效期12个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

【标本采集】

取肠内容物和肠系膜淋巴结；待检活畜，取分泌物和排泄物于离心管中。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

分泌物和排泄物样品直接取100μL于1.5mL灭菌离心管中。

1.2 RNA提取

为了使实验结果稳定、有效、可靠，建议使用商品化的RNA 提取试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

3. 加样（样本处理区）

将步骤1提取的RNA、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；

荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）HEX检测牛呼吸道疾病综合症，淬灭通道（Quencher Dye）NONE，请勿选择ROX参比荧光。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定

设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道Ct值≤38.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道38.0<Ct值<40.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现Ct值<40.0且有典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无Ct值且无明显的扩增曲线。

6. 检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线且无Ct值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤30；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

8. 性能指标

（1）敏感性：内控样本敏感性为100%，综合评价敏感性98%以上。最DI检测限不低于1000copies/ml。

（2）特异性：100%。

（3）稳定性：批内及批间差异≤3%。

【注意事项】

Ø 所有操作严格按照说明书进行；

Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

Ø 反应液应避光保存；

Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø 实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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