考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

规格: 100T/96S

产品内容：

试剂一：液体25mL×1 瓶，4℃保存。

标准品：500μg/mL×1 瓶，4℃保存，临用前用蒸馏水稀释为50μg/mL。

产品说明：

样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。

在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合形成蓝色复合物：该复合物在595nm处有最大吸 收峰。 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该方法灵敏度高，适合微量蛋白质分析。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、移液器和蒸馏水。

操作步骤：

一、样品中可溶性蛋白质提取

1.   液体样品：澄清无色液体样品可以直接测定。

2.   组织样品：按照组织质量 (g) ：提取液体积(mL)为1：5~ 10 的比例 (建议称取约0. 1g组织，加入 1mL 提取液 (自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水) ) 。冰浴匀浆，    10000rpm ，4℃离心10min ，取上清，即待测液。  (动物样品常常需要稀释)

3.   细菌、真菌：按照细胞数量 (104个) ：提取液体积 (mL) 为500~ 1000：1 的比例 (建议500 万细 胞加入1mL 提取液) ，冰浴超声波破碎细胞 (功率300w ，超声3 s ，间隔7s ，总时间3min ) ；然后 10000rpm ，4℃ ，离心10min ，取上清置于冰上待测。

二、吸光值测定

1.   分光光度计预热30 min 以上，蒸馏水调零。

2.   空白管：取0.5 mL EP管，加入40μL 蒸馏水，250μL 试剂一，混匀后室温静置10min ，取200μL 于 微量玻璃比色皿/96孔板，595nm 比色，10~20min 完成比色，记为A 空白管。

3.   标准管：取0.5 mL EP管，加入40μL 标准液，250μL 试剂一，混匀后室温静置10min ，取200μL 于 微量玻璃比色皿/96孔板，595nm 比色，10~20min 完成比色，记为A 标准管。

4.   测定管：取0.5 mL EP管，加入40μL 待测液，250μL 试剂一，混匀后室温静置10min ，取200μL 于 微量玻璃比色皿/96孔板，595nm 比色，10~20min 完成比色，记为A 测定管。

三、蛋白质含量：

C 待测 (μg/mL) =50×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)

C 标准管：标准品蛋白质浓度，50μg/mL。

注意事项：

1.   加考马斯亮蓝后，在10~20min 内吸光值相对较稳定，因此须在10~20min 完成比色。

2.   不宜用石英比色皿，可用玻璃或塑料比色皿，测完成后立即用95%乙醇冲洗。

3.   测定前用1~2 个样做预实验，确保蛋白浓度在0~ 100μg/ml 范围内，否则需要做相应稀释。

本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！

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