甲哨唑(甲硝唑)是一种广谱抗厌氧菌与抗原虫药物，常被非法添加到化妆品、消毒剂及动物源性食品中。使用甲哨唑检测试剂盒进行快速筛查，必须严格执行样本前处理与加样的标准操作程序(SOP)，以保证检测结果的准确性与重复性。
一、适用范围与原理概述
本SOP适用于ELISA类甲哨唑竞争抑制检测试剂盒，样本类型包括畜禽组织匀浆、乳品、蜂蜜及部分化妆品膏霜基质。原理为样品中甲哨唑与酶标物竞争结合抗体，抑制显色反应，通过测定吸光度值计算残留浓度。
二、样本前处理步骤
样品均质与称量
组织样品去除脂肪与筋膜，取代表性部位称重(如5 g)，加入预冷的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2)，比例通常为1:4(W/V)，高速匀浆后冰浴冷却。
蛋白沉淀与提取
加入适量乙腈或甲醇(如样品体积1:2)，涡旋混匀，静置10 min使蛋白变性沉淀；4℃、12,000 rpm离心10 min，收集上清液备用。
净化与浓缩(视基质而定)
对高脂或色素干扰强的样品(如蜂蜜、化妆品)，可采用固相萃取(SPE)C18柱净化：活化—上样—洗涤—洗脱，收集洗脱液并氮气吹干，再用复溶液溶解至规定体积。
过滤与稀释
上清液或复溶液经0.22μm滤膜过滤，按试剂盒说明书取一定量用样品稀释液稀释至检测范围，避免超出标准曲线线性区间。
三、加样流程
试剂回温与混匀
将试剂盒从冷藏取出，平衡至室温(20–25℃)，轻摇微孔板或试剂瓶使液体均匀，避免气泡。
加样顺序
按孔板布局依次加入标准品、质控样与待测样品(每孔体积依说明书，如50μL)；随后加入酶标物(如50μL)，立即加盖封板膜，避免蒸发与污染。
孵育
在恒温摇床或酶标仪配套孵育箱中，按设定温度(通常37℃)与时间(如30 min)孵育，期间避免强光直射。
洗涤
弃去孔内液体，用洗液注满每孔，静置30 s后拍干，重复3–5次，去除未结合物。
显色与终止
加入底物液(如TMB)，避光孵育10–15 min；加入终止液(如2M H₂SO₄)后立即混匀，终止反应。
读数与分析
用酶标仪在450 nm(参考波长630 nm)读取吸光度，代入标准曲线计算样品浓度，质控样需在允许范围内方为有效。
四、注意事项
全程使用一次性枪头与手套，防止交叉污染。
样本提取液若出现浑浊或分层，应再次离心或过滤。
显色时间应严格控制，过长或过短都会影响OD值。
每批次检测设空白孔、阴性对照与阳性对照，确保试剂盒性能正常。
甲哨唑检测试剂盒的样本前处理与加样流程是保证检测灵敏度和特异性的核心环节。严格执行SOP、做好质控记录，可有效降低假阳/假阴风险，为食品安全与化妆品监管提供可靠技术支撑。
