氯霉素检测

组织、肝脏 ································

85%±20%

蜂蜜、肠衣 ································

83%±25%

牛奶、饲料 ································

75%±23%

尿液、血清 ································

70%±18%

三、试剂盒组成

1

微量测试孔

每条 8 孔，一板 12 条

标准液×6 瓶

0ppb

0.05ppb

2

0.15ppb

0.45ppb

（1ml/瓶）

1.35ppb

4.05ppb

3

酶标记物

12ml

红色帽

4

抗体浓缩液

1ml

蓝色帽

5

底物 A 液

7ml

白色帽

6

底物 B 液

7ml

黑色帽

7

终止液

7ml

黄色帽

8

20X 浓缩洗涤液

40ml

白色帽

9

2X 浓缩复溶液

50ml

透明帽

(1 份浓缩复溶掖+1 份去离子水，用于抗体

氮气流下干燥；用 0.5ml 样本复溶液溶解干燥

的稀释和样本提取后的复溶)。

的残留物，混合 30s；

u

样本处理：

3、 取 50 µl 用于分析。

（a）组织、肝脏样本处理方法

样本稀释倍数： 0.5 倍

1、 称取均质后的样本 3±0.05g 于 50ml 离心管中，

检测下限：0.025ppb

定量下限：0.1 ppb

先加入 3ml 去离子水混匀后再加入 6ml 乙酸乙

注：我们推荐 0.1 ppb 为阳性样本的 cut off 值。

酯，振荡 2min，室温 4000r/min 以上离心 10min；

（e）肠衣处理方法

2、 取出 4ml 上层液体在 50-60℃氮气流中吹干；

1、 用均质器均质样本；注：干样本需剪碎（长度

3、 加入 1 ml 正己烷溶解干燥的残留物，再加 1ml

不超 5mm）后再均质，湿样本需用去离子水漂

样本复溶液混合 30s，室温 4000r/min 以上离心

洗 20min 以上去除表面的盐份，沥干后再均质；

5min；去除上层有机相；

2、 称 1±0.05g 均质后的样本于 50ml 离心管中，加

4、 取 50 µl 下层相用于分析。

入 10ml 乙酸乙酯，振荡 2min，室温 4000r/min

样本稀释倍数:  0.5 倍

以上离心 10min；

（b）血清血浆处理方法

3、 取 5ml 上层液体（相当于 0.5g 的样本）在氮气

1、 取 1ml 血清或血浆至试管中，加 2ml 乙酸乙酯

流下 50-60℃干燥；

振荡 1min；静置使水相与有机相分层或室温

4、 加入 1 ml 正己烷溶解干燥的残留物，再加 0.5ml

4000r/min 离心 5min；

样本复溶液振荡混合 30s，室温 4000r/min 以上

2、 移取上层的乙酸乙酯至另一试管中，用氮气流

离心 5min；除上层有机相；

50℃水浴中干燥；残留物用 1 ml 样本复溶液溶

5、 取下层 50 µl 用于分析。

解，混合 30s；

样本稀释倍数： 1 倍

3、 取 50 µl 下层相用于分析。

（f）牛奶样本处理方法一

样本稀释倍数:  1 倍

1、 将牛奶样本 10℃4000r/min 以上离心 10min 处

（c） 尿液处理方法

理，吸除上层脂肪；然后取 5ml 去除脂肪奶样

1、 移取 2ml 尿液到离心管中，加 pH4.8 100mM 醋

至 50ml 离心管中，加入 150µl C 液出现沉淀，

酸钠缓冲液 0.5ml 混合；加 40µl 葡萄糖苷酸酶

短暂振荡后加入 150µl D 液混合；

(Merck,Art.No.4114)到稀释的尿液中，在 37℃

2、 15℃4000r/min 以上离心 10min，移取上层液；

水解至少 2 小时（或过夜）；

用样本复溶液以等体积稀释上层液，混合 30s；

2、 该溶液恢复至室温后加入 8ml 乙酸乙酯混合

3、 取 50µl 用于分析。

1min；室温 4000r/min 离心 10min，取出 4ml

注：如果离心后仍然浑浊，再重复沉淀过程。

上层液体在氮气下 50～60℃干燥；

样本稀释倍数：2

3、 用 1ml 样本复溶液溶解干燥的残留物，混合

检测下限：0.1ppb

定量下限：0.15ppb

30s；

（g）牛奶样本处理方法二

4、 取 50µl 用于分析。

1、 将牛奶样本 10℃4000r/min 以上离心 10min 处

样本稀释倍数:  1 倍

理，吸除上层脂肪；然后取 5ml 去除脂肪奶样

（d）蜂蜜处理方法

至 50ml 离心管中，加入 250µl C 液和 250µl D

1、 取 2±0.05 g 蜂蜜，放入离心管中，用 4ml 去离

液*混合，4-12℃4000r/min 以上离心 10min。

子水溶解；加入 4ml 乙酸乙酯振荡 2min，室温

如无冷冻离心机，将样本置冰箱中冷却到 8℃；

4000r/min 以上离心 10min；

2、 转移出 2.2ml 上层液（相当于 2ml 奶样）至新

2、 移取 2ml 上层清澈液到另一离心管中，50-60℃

的离心管中，加入 4ml 乙酸乙酯上振荡 2min；

检测下限：0.1ppb

定量检测限：0.3ppb

7、 将孔内液体甩干，用已稀释的洗涤液 250µl/孔

（j）饲料处理方法

洗板 4～5 次，每次间隔 15～30 秒，用吸水纸

1、 称取 2±0.05g 均质过的饲料样本，加入 2ml 去

拍干（拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺

离子水，再加入 6ml 乙酸乙酯，充分振荡 2min，

破）。

15℃ 4000r/min 以上离心 10min；

8、 每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置25℃

2、 取 3ml 上层有机相到试管中 56℃下氮气吹干；

环境中反应 30min。将孔内液体甩干，用洗涤

3、 加入 1ml 正己烷溶解残留物，用 1ml 样本复溶

液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水纸拍干（拍

液混合 30s，室温 4000r/min 以上离心 5min；去

干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

除上层有机相；

9、 显色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B

4、 取 50 µl 用于分析。

液 50µl/孔，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显

样本稀释倍数：1

色 15min。

六、 酶标免疫分析程序:

10、 测定：加入终止液 50µl/孔，轻轻振荡混匀，

设定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长 450/63

u

测定前应须知：

0nm 检测，5min 内读数），测定每孔 OD 值。

1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温

（20～25℃）。

七、结果判定

2、 使用之后立即将所有试剂放回 2～8℃。

结果判定有两种方法，粗略判定可用第 1 种方

3、 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于

法，定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与

洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定

其所含氯霉素量成负相关。

程序中的要点。

1、粗略判定：

4、 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出

盖住微孔板。

其浓度范围(ng/ml)。假设样本 1 的吸光度值为 0.3，

u

操作步骤：

样本 2 的吸光度值为 1.0，标准液吸光度值分别是：

1、 从 2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～

0ppb 为 2.243；0.05ppb 为 1.816；0.15ppb 为 1.415；

25℃）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使

0.45ppb 为 0.74；1.35ppb 为 0.313；4.05ppb 为 0.155。

用前均须摇匀。

则样本 1 的浓度范围是 1.35ppb～4.05ppb；样本 2

2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放

的浓度范围是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其对应的稀

入自封袋，保存于 2-8℃。

释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。

3、 配液：将 40ml 浓缩洗涤液（20 倍浓缩）用去

2、定量分析

离子水按照 1：19 稀释（1 份浓缩洗涤液+19 份

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分

去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双

4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每

孔）除以*个标准（0 标准）的吸光度值，再乘

个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和

以 100%，即

样本孔所在的位置。

B

5、 将浓缩抗体用样本复溶液 11 倍稀释（1 份抗体

百分吸光率（%）＝

×100%

加入 10 份稀释液，按需配制使用）

B0

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

6、 加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加

B₀—0ng/ml 标准溶液的平均吸光度值

加入抗体工作液 50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻

（2）标准曲线的绘制与计算

振荡混匀。25℃环境中反应 30min。

以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准