提供商: 上海研谨生物
服务名称: western blot服务
规格: 实验服务
实验步骤:
一、试剂准备
1. SDS-PAGE试剂: 见聚丙烯酰.胺凝胶电泳实验。
2.匀浆缓冲液: 1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml; 10%SDS 6.0 ml; β-巯基Z醇
0.2 ml; ddH2O 2.8 ml.
3.转膜缓冲液:甘氨酸29g; Tris5.8g; SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH20定容至
1000 ml.
4.0.01 M PBS(pH7.4): NaCl8.0g; KC10.2 g; Na2HPO4 1. 44 g; KH2PO4 0.24 g;
加ddH20至1000ml。
5.膜染色液:考马斯亮兰0.2g;甲醇80 ml;乙酸2 ml; ddH2O118 ml。 包被液(5%脱
脂奶粉,现配) :脱脂奶粉1.0 g溶于20 m的0.01 M PBS中。
6.显色液: DAB 6.0 mg; 0.01 M PBS 10.0ml; 硫酸镍胺0.1 ml; H202 1.0 μl。
二、蛋白样品制备
1.单层贴壁细胞总蛋白的提取
(1)倒掉培养液, 并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一
钆使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。
(2)每瓶细胞加3 ml 4°C预冷的PBS (0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1 min洗涤
细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净
后把培养瓶置于冰上。
(3)按1m 裂解液加10 μl PMSF (100 mM),摇匀置于冰上。(PMSF 要摇匀至无结晶
时才可与裂解液混合。)
(4)每瓶细胞加400μ含PMSF的裂解液,于冰上裂解30 min,为使细胞充分裂解培养
瓶要经常来回摇动。
(5)裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快), 然后用枪将细
胞碎片和裂解液移至1.5 mI离心管中。(整个操作尽量在冰 上进行。)
(6)于4°C下12000 rpm离心5 min。(提前开离心机预冷)
(7)将离心后的.上清分装转移倒0.5 m的离心管中放于- 20°C保存。
2.组织中总蛋白的提取
(1)将少量组织块置于1 ~ 2 m匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪
碎。
(2)加400 μL单去污剂裂解液裂(含PMSF)匀浆器中,进行匀浆。然后置于冰上。
(3)几分钟后再碾一会儿再置于冰上, 要重复碾几次使组织尽量碾碎。
(4)裂解30 min后,即可用移液器将裂解液移至1.5 mI离心管中,然后在49C下12000
rpm离心5 min,取上清分装于0.5 mI离心管中并置于- 20°C保存。
3.加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取
由于受药物的影响,一些细胞脱落下来,所以除按1操作外还应收集培养液中的细
胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取:
(1)将培养液倒至15 m|离心管中,于2500 rpm离心5 min.
(2)弃上清,加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤,然后2500 rpm离心5 min。弃上清
后用PBS重复洗涤--次。
(3)用枪洗干上清后,加100 μL裂解液(含PMSF) 冰上裂解30 min,裂解过程中要经
常弹一弹以使细胞充分裂解。
(4)将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起49C、 12000 rpm离心5 min,取上清分装于
0.5 mI离心管中并置于- 20C保存。
三、蛋白含量的测定
1.制作标准曲线
(1) 从- 20°C取出1 mg/ml BSA, 室温融化后,备用。
(2)取18个1.5 mI离心管, 3个一组,分别标记为0 mg, 2.5mg, 5.0mg,10.0 mg,
20.0mg, 40.0mg。
(3)按下表在各管中加入各种试剂。
(4)混沟后,室温放置2 min。在生物分光光度计(Bio-Photometer, Eppendorf).
上比色分析。
2.检测样品蛋白含量
(1)取足量的1.5ml离心管,每管加入4°C储存的考马斯亮蓝溶液1ml。 室温放置
30 min后即可用于测蛋白。
(2)取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCI容液100 ml,混匀放置2分钟可做为空白样
品,将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
(3)空白样品,用无水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL),再用无菌水洗- -次。
(4)取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15 mol/L NaCI NaCI溶液和5mI待测蛋白样品,
混匀后静置2 min, 倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意:每测一个样品都要将比色杯用无水Z醇洗2次,无菌水洗一次。 可同时混合好
多个样品再一起测,
这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5mI样品含的蛋白量。
四、SDS- PAGE电泳
1.清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,
再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2.灌胶与上样
(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。(操作时要使两
玻璃对齐以免漏胶。)
(2)按前面方法配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时,可用10m
枪吸取5m胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层
水,液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速
度。操作时胶-定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢,
否则胶会被冲变型。)
(3)当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可
倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓
缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产
生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的
上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固
后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(5)用水冲洗-下浓缩胶,将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内,大玻璃板面向
外。若只跑一块胶,那槽另- -边要垫一块塑料板且有字的- -面面向外。)
(6)测完蛋白含量后,计算含50ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至
0.5m离心管中,加入5xSDS.上样缓冲液至终浓度为1x。(上样总体积-般不超过15
μl,加样孔的大限度可加20μ样品。)上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白
变性。
(7)加足够的电泳液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。 )用微
量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓
慢加入样品。(加样太快可使样 品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入
下-个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次,以免交叉污染。
3.电泳
电泳时间一般4 ~5h,电压为40 V较好,也可用60 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止
电泳,进行转膜。
五、转膜
1.转一张膜需准备6张7.0~ 8.3 cm的滤纸和1张7.3 ~ 8.6 cm的硝酸纤维素膜。切
滤纸和膜时-定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于
水上浸2 h才可使用。(用镊子捏住膜的-边轻轻置于有超纯水的平皿里,要使膜浮
于水上,只有下才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸
湿。若膜沉入水里,膜与水之间形成一-层空 气膜,这样会阻止膜吸水。
2.在加有转移液的搪瓷盘 里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、-支玻棒、滤纸和浸
过的膜。
3.将夹子打开使黑的一 面保持水平。在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以
擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫三层
滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上),一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气
泡。
4.要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。
撬-会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。(撬时一 定要小心,玻板很易裂。)除
去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。 小
心剥下分离胶盖于滤纸上,手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖
于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去
气泡。后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行,
要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。(转移液含
甲醇, 操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通。)
5.将夹子放入转移槽槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。电转
移时会产热,在槽的一边放一块冰来降温。一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h. .
6.转完后将膜用1x丽春红染液染5 min (于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上
的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。
六免疫反应
1.将膜用TBS从下向上浸湿后,移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动
封闭1h。
2. 将抗用TBST稀释至适当浓度(在1.5 m离心管中) ;撕下适当大小的-块儿保鲜膜
铺于实验台面上,四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;将抗体溶液加到保鲜膜上;从
封闭液中取出膜,用滤纸吸去残留液后,将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,掀动膜
四角以赶出残留气泡;室温下孵育1~2 h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次
10 min;再用TBS洗-次,10 min.
3.同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下孵育1 ~2 h后,用TBST在室温下脱
色摇床上洗两次,每次10 min;再用TBS洗- -次, 10 min,进行化学发光反应。
七、化学发光,影,定影
1.将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合; 1 min后,将膜蛋白面朝下与此混合液充
分接触; 1 min后,将膜移至另一保鲜膜上,去尽残液,包好,放入X-光片夹中。
2. 在暗室中,将1x显影液和定影液分别到入塑料盘中;在红灯下取出X -光片,用切
纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1 cm) ;打开X-光片夹,把X -光片放在膜
上,-旦放上,便不能移动,关上X光.陕,开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光
时间,-般为1 min或5 min,也可选择不同时间多次压片,以达+*佳效果;曝光完
成后,打开X-光片夹, 取出X-光片, 迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带
后,即刻终止显影。显影时间-般为1~2 min (20~ 25°C),温度过低时(低于
16°C) 需适当延长显影时间;显影结束后,马上把X-光片浸入定影液中,定影时
间-般为5 ~ 10 min,以胶片透明为止;用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾
干。
应注意的是:显影和定影需移动胶片时,尽量拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否
则会对结果产生影响。
八凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
展开
注意事项:
1.一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定+*佳条
件。
2.显色液必须新鲜配置使用,后加入H2O2。
3. DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。
其他:
一、免疫反应
1.用0.01 M PBS洗膜,5 min x3次。
2.加入包被液,平稳摇动,室温2 h。
3.弃包被液,用0.01 M PBS洗膜,5 minx3次。
4.加入一抗(按合适稀释比例用0.01 M PBS稀释,液体必须覆盖膜的全部),49C 放
置12 h以上。阴性对照,以1%BSA取代-抗,其余步骤与实验组相同。
5.弃-抗和1%BSA,用0.01 M PBS分别洗膜,5 minx4次。
6.加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01 M PBS稀释),平稳摇
动,室温2 h。
7.弃二抗,用0.01 M PBS洗膜,5 minx4次。
8.加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
实验代做服务:
ELISA试剂盒免费代检测 | CCK8检测 | 基因组DNA提取 | 蛋白相互作用分析 |
Western Blot | 免疫组化 | 荧光定量PCR | 动物模型服务 |
流式细胞检测 | ROS氧化分析 | 激光共聚焦 | DNA甲基化实验 |
细胞划痕 | 钙离子浓度检测 | 扫描电镜实验 | microRNA测序 |
动物实验 | 探针合成 | ATP/ADP检测 | 石蜡/冰冻切片 |
定点突变 | 线粒体膜电位(MMP)检测 | 细胞生长曲线的测定 | 药理毒理动物实验 |
免疫共沉淀 | 真核表达载体构建 | 染色质免疫沉淀CHIP | 非标定量(Label-free)实验 |
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